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目的:构建含有人肾细胞癌特异性抗原G250(CAⅨ)主要T细胞表位区域、猴和鼠CAⅨ部分片段区域融合基因tG250的真核表达质粒,并在猴肾COS7细胞中表达.方法:通过基因合成和PCR技术构建人、猴和鼠G250区域融合基因tG250,将其插入含有人Igk链前导信号肽(sig)、人IgG_Fc和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI-Fc-GPI中,继而又将酶切后的sig-tG250-Fc-GPI融合基因导入含有细小病毒内部核糖体结合位点(IRES)基因且可以共表达人GM-CSF和B7.1融合基因的真核表达载体pVAX1-IRES-GM/B7中;将构建的重组质粒pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-GM/B7转染COS7细胞,利用流式细胞仪和免疫荧光检测其表达.结果:测序结果表明tG250融合基因序列正确,PCR和酶切鉴定证明已将其连入真核表达载体pVAX1-IRES-GM/B7中;流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组质粒pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-GM/B7在COS7细胞中得到很好的表达.结论:构建了重组质粒pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-GM/B7,且在COS7细胞中有效表达,为以G250为靶点的抗肾细胞癌基因疫苗的构建与功能研究奠定了基础. |
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